背景：
在骨外科手術的臨床應用中，肌腱/韌帶斷裂通常通過肌腱/韌帶重建術來治療。在該重建術中，斷裂的肌腱/韌帶末端通常使用傳統(tǒng)實心金屬螺釘固定，然而由于實心螺釘的應力屏蔽和術后松動問題，使得其對肌腱/韌帶末端的長期固定效果非常有限。隨著增材制造技術的發(fā)展，一系列多孔拓撲結構被發(fā)現能夠額外應用于傳統(tǒng)實心金屬螺釘中。通過在實心螺釘中引入合適的增材制造多孔拓撲結構，可以有效地避免螺釘內應力屏蔽的發(fā)生，并且隨著骨與肌腱/韌帶組織逐漸再生長入螺釘的孔隙中，螺釘術后松動的風險能得到顯著降低。本研究的主要目的是通過一系列生物實驗，探究針對骨與肌腱/韌帶組織再生的優(yōu)勢拓撲結構，從而為提高肌腱/韌帶重建術螺釘的長期固定效果提供較為可行的一種拓撲優(yōu)化方案。
方法：
采用 Mathematica 軟件設計了Fischer-Koch S、Octet、Diamond、Double Gyroid 四種增材制造多孔拓撲結構下的多孔螺釘，并采用電子束熔化（EBM）三維打印機進行螺釘的打印與制造。初步測試該四種螺釘的力學性能（von Mises 應力分布、楊氏模量、名義屈服強度），并在此之后針對該四種多孔螺釘進行了一系列的體外和體內實驗，從而探索這幾種螺釘在成骨和肌腱/韌帶生成方面各自的生物學功能，并最終篩選出4 種孔形結構中成骨與成肌腱/韌帶性能最為優(yōu)良的一種。
結果：
與實心螺釘相比，這4 種增材制造拓撲優(yōu)化多孔螺釘均表現出更好的力學性能。在后續(xù)的生物實驗中發(fā)現，設計成Fisher-Koch S 多孔結構的螺釘在促進骨再生方面更具效果，而設計成Octet 多孔結構的螺釘在促進肌腱/韌帶再生方面表現出更大的潛力。
結論：
與傳統(tǒng)的實心設計相比，增材制造多孔拓撲結構具有力學與生物學上的諸多優(yōu)點，當其被應用于肌腱/韌帶重建術螺釘內時，能夠有效提升螺釘植入后的長期固定效果。隨著多孔結構的引入，螺釘模量降低到骨小梁組織的合理值范圍內。此外，多孔組織結構可以為再生骨和肌腱/韌帶組織的原位長入和整合帶來更多的孔隙空間，螺釘對肌腱/韌帶末端的固定效果和固定強度將顯著提升。在這四種結構中，Fischer-Koch S 結構被發(fā)現對骨再生更有效，Octet 結構被證明更適合改善肌腱/韌帶再生。基于這些發(fā)現，提出了Fischer-Koch S-Octet 雙層螺釘結構，該結構可用于肌腱/韌帶重建術螺釘的拓撲優(yōu)化，并有效提高螺釘的長期固定效果。
關鍵詞：
增材制造，拓撲優(yōu)化，骨，肌腱/韌帶，螺釘
1.1 肌腱/韌帶組織的結構基礎肌腱與韌帶是人體運動系統(tǒng)的重要組成部分，廣泛分布于人體的運動關節(jié)區(qū)域。肌腱連接著運動肌肉以及骨骼，傳導來自肌肉的牽拉力，發(fā)揮著引起關節(jié)產生運動的關鍵功能，如肩袖肌腱、髕腱、跟腱等；韌帶連接著相鄰的兩塊骨骼，一般起到固定連接關節(jié)的作用，如關節(jié)側副韌帶、前后交叉韌帶、棘間韌帶等。肌腱和韌帶在組織結構和成分上具有高度的相似性，被認為具有高度的組織同源性，且在人體關節(jié)運動中承受著軸向的應力，容易在劇烈的暴力下發(fā)生斷裂，產生一個亟待手術修補連接的相似斷端。肌腱和韌帶主體都是由膠原纖維構成的，且膠原纖維由規(guī)則的特殊軸向層級結構組成。膠原纖維最基本結構單位是I 型膠原分子，它首先以5 個成簇的形式扭曲形成微纖絲，即最基礎的纖維束結構。接下來，大的微纖絲束沿著肌腱或韌帶軸向進行平行的空間重復，從而形成了次級纖維束結構--原纖絲。原纖絲的直徑約為100-500 納米，具體的粗細則取決于它所包含的微纖絲的數量的多少。然而不管原纖絲具體的粗細為多少，其均具有相似的內部結構，在電子顯微鏡下觀察，可以發(fā)現所有的原纖絲內部均具有相同周期性的分子結構--D 帶。D 帶沿原纖絲每隔67 nm 的空間距離出現一次，該結構可以從側面反映微纖絲在原纖絲內是彼此富有規(guī)律地分布與結合，具有空間的周期性[1]。接下來，通過包括蛋白聚糖在內的各種生物分子的作用，許多原纖絲彼此進行交聯，并一齊被初級內膜包裹，形成了一個大的膠原纖維分子。若干數目的膠原纖維分子被次級內膜包裹形成纖維束，而后若干數目的纖維束被肌腱/韌帶外膜包裹最終形成完整的肌腱/韌帶組織結構[2, 3]。在肌腱/韌帶內，膠原纖維分子之間以及纖維束之間均具有一定的活動度，包裹它們的膜鞘彼此自由接觸并不粘連為整體，這使得膠原纖維和纖維束原則上可以輕微移動和橫向滑動[1-5]。在組織學層面上，肌腱/韌帶內的營養(yǎng)血管網主要分布在外膜和次級內膜上，血管周圍偶爾可伴有微小的神經和淋巴管毛細血管，這些微血管神經在中央的深部區(qū)域內則很少能觀察[3, 5, 6]。這些微血管的平均直徑很小，血液流經它們的速度非常慢。這些組織學證據表明肌腱/韌帶的總血容量相比于其他組織（如皮膚或肌肉組織）要低得多，并且其內部的營養(yǎng)物與廢物物的交換主要依賴于組織基質的擴散途徑，這不足以滿足細胞旺盛代謝的需要。在細胞加速生長、增殖或分化的過程中，這種營養(yǎng)缺乏現象可能更為嚴重。因此，上述解剖特征導致肌腱/韌帶內部受限的營養(yǎng)交換可以一定程度上解釋為什么肌腱/韌帶內的細胞密度低。肌腱/韌帶組織55-70%的組織成分是細胞外基質(ECM)，其中主要成分又是水，這也可以解釋為什么肌腱/韌帶受到損傷后一般組織愈合的速度比較緩慢[7]。在細胞組成方面，肌腱/韌帶主要由下列這幾種細胞類型組成，包括纖維細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、神經細胞和各種免疫細胞（肥大細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等）[8]。纖維細胞是肌腱/韌帶中最常見的細胞類型，約占所有細胞中的90%-95%比例[7]。纖維細胞多來源于成纖維細胞，成纖維細胞一般局部分布于原纖絲間隙內，其具有比纖維細胞更大的分化潛能和更高的細胞增殖速率[2, 9-11]。纖維細胞和成纖維細胞是肌腱/韌帶中細胞外基質的主要產生者，它們產生并分泌了了幾乎所有的細胞外基質成分。在不考慮水分的情況下，肌腱/韌帶中細胞外基質主要由膠原纖維組成，占到組織干重的60%-85%。I 型膠原分子的含量最多（80%-90%），其次為III 型膠原分子（1%-10%）和II 型膠原（2%）。肌腱/韌帶細胞外基質中還含有少量的彈性蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖（GAGs）和糖蛋白等。這些功能性生物分子可以增強肌腱/韌帶的剛度、韌性和粘彈性等生物力學性能。1.2 肌腱/韌帶的螺釘重建與潛在風險肌腱和韌帶不僅具有相似的組織結構，當發(fā)生意外受損與斷裂的情況時，臨床上針對肌腱/韌帶斷端所采取的手術修復方式也比較相似。由于肌腱/韌帶是承受較大牽拉應力的特殊組織，因此術者為了盡量提高肌腱/韌帶斷端的術后固定效果，一般多采用螺釘對肌腱/韌帶斷端加以固定。為了恢復肌腱/韌帶與相鄰骨塊之間的解剖連接，首先可在受損的肌腱/韌帶原始附著部位附近鉆取一個直徑與螺釘直徑相當、深度與螺釘長度相當的骨性隧道，然后將游離的肌腱/韌帶斷端插入骨性隧道，并最后植入選取的金屬螺釘將斷端肌腱/韌帶牢牢固定在骨性隧道內[12-15]。傳統(tǒng)的金屬螺釘通常采取的是常規(guī)實心結構的設計，作為植入于骨組織內的金屬物體，不可避免地將會造成應力屏蔽現象，即植入了螺釘后的骨塊內部，應力將會集中分布于螺釘區(qū)域，而不是均勻地分布在螺釘以及鄰近骨組織區(qū)域內[16, 17]。這一問題可能會導致實心螺釘附近的正常骨組織迅速退化，長期將導致嚴重的骨質疏松甚至病理性骨折的發(fā)生[18, 19]。此外，當修復重建的肌腱/韌帶在運動狀態(tài)下繃緊時，來自肌腱/韌帶的拉應力會通過螺釘外側壁與固定的肌腱/韌帶末端之間的摩擦力持續(xù)牽拉植入的螺釘釘體，這將不可避免地使螺釘產生松動，在最嚴重的情況下會導致螺釘的脫落與肌腱/韌帶重建的失敗[20-22]。隨著時間的推移，上述問題會不斷地增加植入螺釘的不穩(wěn)定性，這引起了研究人員對肌腱/韌帶重建金屬螺釘長期固定效果有關的的擔憂。1.3 多孔化設計的優(yōu)勢與增材制造技術的發(fā)展為了解決上述發(fā)生的問題，盡量提高肌腱/韌帶重建中植入螺釘的長期固定效果，應將傳統(tǒng)的實體螺釘設計摒棄，改為整體多孔的結構設計。當在金屬螺釘中引入了多孔化結構的設計后，可以使得螺釘的楊氏模量顯著降低，甚至降低至天然蜂窩骨組織的楊氏模量值范圍內（1.2-22.3 GPa）[23]，進而有效地避免應力屏蔽現象的發(fā)生。此外，既往有關研究證明，應用于骨科植入物的多孔結構設計能夠有效誘導新生骨組織在植入物中的長入[24-26]。因此，在金屬螺釘中采用多孔結構設計，可以增加骨組織在螺釘表面及內部的生長，隨著更多的再生骨組織與螺釘相互結合，螺釘的術后固定強度將會隨著時間的推移而不斷提升。在肌腱/韌帶重建這一特殊的臨床情景中，植入的螺釘不僅與骨組織相互接觸，同時還接觸并固定著肌腱/韌帶的斷端，因此當螺釘的內部引入了適當的多孔結構后，也可能獲得額外的肌腱/韌帶組織浸潤生長能力。當再生的肌腱/韌帶組織也能逐步長入到多孔螺釘中，重建的肌腱/韌帶斷端的機械強度和固定效果也能得到顯著的提升，重建固定的肌腱/韌帶斷端發(fā)生意外脫落的可能性也會逐漸降低。因此，為了提高肌腱/韌帶重建螺釘的長期固定效果，在實心螺釘內引入適當的多孔化設計是很有必要的。隨著增材制造技術的發(fā)展，骨科植入物的生物功能優(yōu)化成為了時下的研究熱點，而其中在植入物內引入有利于成骨再生的特定拓撲結構是重要的研究方向之一。一些相關的體外實驗發(fā)現，在骨科植入物中引入不同的拓撲結構可以為接觸著植入物的動物細胞提供一個獨特的細胞外微環(huán)境，從而直接地影響著細胞的代謝生長行為，包括細胞粘附、遷移、增殖和分化等[27-30]。此外，一些體內實驗也證明，骨科植入物內所引入的額外的拓撲結構設計會影響著“植入物-動物組織”界面上組織的再生速率[31-33]。優(yōu)化的拓撲結構設計可以用來調節(jié)多孔植入物的組織長入能力，具體選取的結構設計類型需要與植入物所植入組織的具體類型相互匹配。為了提高肌腱/韌帶重建螺釘的整體固定效果，此時需要選取適合于骨組織和肌腱/韌帶組織生長的拓撲結構類型，從而促進骨組織和肌腱/韌帶組織組織在重建部位的再生。本研究選取了四種經典的增材制造多孔結構設計：Fischer-Koch S、Octet、Diamond 和Double Gyroid 結構，它們被廣泛應用于骨科植入物，其中也包括金屬螺釘這一常見的骨科植入物[34-42]。Fischer-Koch 、Diamond 和Double Gyroid 結構是三周期最小曲面（Triple Periodic Minimal Surface, TPMS）拓撲類別下的三種典型結構[38, 42]，Octet 結構則是原型拓撲類別下的一種經典結構[40]。這四種結構（TPMS 和原型拓撲）屬于超材料范疇，其生物力學性能是由其自身的空間拓撲結構所決定的，而非由制造的具體組分材料（金屬、高分子聚合物等）所決定的[39, 43-45]。這四種結構是具有高度骨組織仿生度的理想設計，尤其是與天然骨小梁結構相比，具有理想的骨小梁蜂窩結構特征[39, 46-48]。此外，這四種結構都是基于參數化設計的，這表明可以研究者通過調整相關幾何參數，從而精準調節(jié)這些結構下的骨科植入物的孔隙率數值。因此，這些結構下的骨科植入物的力學性便能可以很容易地調節(jié)到所需的天然骨組織范圍內?；谝陨蟽?yōu)勢，這四種增材制造拓撲結構設計均適用于肌腱/韌帶重建金屬螺釘的拓撲優(yōu)化情景。為了檢驗這四種結構的實際生物學效應，篩選出最合適于骨組織和肌腱/韌帶組織再生的特殊結構，本研究設計并制造了這四種結構下的不同生物支架，并針對這四種結構下的生物支架開展了一系列體外和體內實驗，借此探究這些拓撲結構設計在骨與肌腱/韌帶再生方面的潛在特征。 
2.1 生物實驗支架模型的設計與模擬分析Fischer-Koch S、Octet、Diamond 與Double Gyroid 四種增材制造拓撲微孔結構的物體（如骨科假體或生物支架等）都是基于它們的代表性體積單元構成的，如圖2.1A 所示，四種不同的代表性體積單元的空間結構由結構數學函數的幾何參數或原型拓撲的幾何參數嚴格定義（見表2.1）。Fischer-Koch S、Diamond 和Double Gyroid 結構屬于TPMS 類別，其代表性體積單元結構受所表中不同形式的隱式函數的限制；Octet 結構屬于原型范疇，其代表性體積單元結構受到固定空間八面體結構的限制。不同的代表性體積單元代表了不同增材制造拓撲結構所具有的典型特征，通過其自身在空間中進行多次的平移對稱復制，大量堆疊，形成相應代表性體積單元的批量陣列，批量列陣再根據實際物體形狀進行切割或融合加工，于是生成了不同增材制造拓撲結構下的多孔物體。本實驗基于上述設計流程，應用Mathematica（Version 12.0）數字建模軟件，制造出了Fischer-Koch S、Octet、Diamond 與Double Gyroid 四種拓撲微孔結構的細胞實驗支架和動物實驗螺釘支架的簡單模型，如圖2.1B-2.1C 所示。 
在 Mathematica 軟件中，四種不同拓撲結構的代表性體積單元3D模型被生成制造，體積單元的尺寸統(tǒng)一設置為1×1×1mm 值下的立方體，用于接下來體外與體內生物實驗支架的設計制造環(huán)節(jié)。既往文獻發(fā)現，為了盡可能地提高骨科多孔支架的骨仿生度，需要盡量在支架內部模擬人體蜂窩骨組織的結構特征，而衡量蜂窩骨組織結構的關鍵數據一般包括骨的孔隙率與骨內部的平均孔徑大小，人體蜂窩骨的孔隙率一般在70%左右，孔徑大小一般在550 μm 左右，因此我們計劃將四種拓撲結構的多孔支架的孔隙率與平均孔徑統(tǒng)一為上述值[49]。通過控制表一中的四個關鍵空間參數值，即可以實現對應結構多孔支架孔隙率與平均孔徑的精確調節(jié)，本實驗通過計算，最終得到當C1、d/?、C2、C3、C4 分別設置為0.305、0.269、0.365、1.000、2.104 時，可將四種類型多孔支架的孔隙率與平均孔徑統(tǒng)一為70%與550 μm。基于上述四種不同拓撲結構的代表性體積單元及相應的批量陣列，我們設計出直徑10 mm、高度2 mm 的片狀體外細胞實驗支架模型與直徑5 mm、高度8 mm 的柱狀體內動物實驗支架模型（圖2.1B-2.1C）。上述支架模型均以立體光刻文件（Stereolithography，STL）的格式輸出，用于后續(xù)的3D 打印處理。 
在正式 3D 打印前，有必要對上述四種多孔支架的機械強度做初步的模擬分析，為此，我們導出了四種代表性體積單元的2×2×2 批量陣列，作為四種拓撲結構的多孔支架的簡化模型（圖3.1B）。將上述四種簡化模型輸出的STL 導入Comsol （Version 5.3）有限元分析軟件，進行初步的應力模擬分析。在傳統(tǒng)的骨科金屬植入物中，鈦合金（Ti6Al4V）具有優(yōu)良的機械強度和良好的生物相容性，因此我們選其作為支架3D 打印與應力模擬分析的主體材料[50-52]。在Comsol 軟件的體塊設置模塊中，將導入的多孔支架的簡化模型的材料屬性勾選為“Ti6Al4V”，網格形狀勾選為“四面體網格”，網格質量勾選為“次級細分”（圖3.1C）。在Comsol 軟件的應力設置模塊中，將邊界載荷設置在支架的上表面，固定約束設置在下表面，垂直應力設置為5×107 MPa 大小，從而模擬計算出該應力條件下不同支架內部的von Mises 應力分布情況。2.2 體內外生物支架打印本實驗采用 EBM 3D 打印機（Arcam）對設計好的體內外支架進行3D 打印與制造。打印前，支架模型的STL 文件依次輸入打印機的操作系統(tǒng)，并選擇粒徑范圍在45-100 μm 的Ti6Al4V 球形粉末裝載入打印機內，作為打印的初始材料。待機器的打印程序完成、打印倉冷卻后，取出打印好的支架，在高速風倉內簡單吹除剩余粉末，并將支架浸于水中進行超聲振蕩清洗一整夜，徹底清除多孔支架內的殘留粉末。上述體內外支架的3D 打印制造與處理過程在吉林省長春市吉林大學第二醫(yī)院骨科研究所完成。
2.3 支架表征及結構檢測
將打印初始材料的Ti6Al4V 球形粉末樣品和四種類型的體外多孔支架樣品裝入掃描電子顯微鏡（SEM，Regulus8100），逐一拍攝不同樣品在50、500、1000 倍放大下的表面形貌電子照片。再次準備相同的Ti6Al4V 粉末樣品與體外多孔支架樣品，將樣品裝入能量色散光譜儀（EDS，IXRF3310），依次分析打印前后不同樣品內部的元素組成。
2.4 機械強度測試
為了探究經 EBM 3D 打印得到的四種不同拓撲結構多孔支架之間的實際機械性能差異，我們使用了電子萬能試驗機（ZWICK-Z250）評估了打印后四種體內螺釘支架樣品與同尺寸下實心圓柱螺釘的壓縮模量和名義屈服強度。測試中設置電子萬能試驗機的十字頭的壓縮速度為1 mm/min，在整個壓縮過程中實時輸出不同樣品的應力-應變曲線。應力-應變曲線開始的直線段斜率即定義為不同樣品的壓縮模量，同時基于該曲線，計算得到四種支架與實心樣品的名義屈服強度（發(fā)生0.2%塑性形變時對應的應力），分別反映不同樣品之間的實際機械強度水平。
2.5 體外細胞實驗
為了在體外細胞層面探究Fischer-Koch S、Octet、Diamond 與Double Gyroid 四種增材制造拓撲微孔結構對成骨與成肌腱/韌帶的影響，我們分別選取了小鼠成骨前體細胞MC3T3-E1（iCell M075TM）與小鼠胚胎成纖維細胞C3H10T1/2（iCell M031TM），用在接下來的一系列細胞實驗之中，通過這些細胞實驗來充分探究上述四種拓撲微孔結構對成骨細胞增殖分化以及對成纖維細胞增殖分化的潛在影響。
2.5.1 細胞培養(yǎng)和接種
將購買的原代 MC3T3-E1 細胞浸于37 °C 水浴箱中完全復蘇，接種在培養(yǎng)皿（100 × 20 mm 規(guī)格）中，用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL 硫酸鏈霉素的高糖杜爾貝科氏改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM，Gibco）10 mL 進行細胞培養(yǎng)，將細胞傳代至第3 代。同理，將購買的原代C3H10T1/2 細胞充分復蘇，用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 硫酸鏈霉素的低糖阿爾法低必需培養(yǎng)基（α-MEM，Gibco）進行細胞培養(yǎng)，并將細胞傳代至第3 代。當貼壁增殖的第三代MC3T3-E1 或C3H10T1/2 細胞覆蓋約90%的培養(yǎng)皿時，用2 mL 0.25%濃度的胰蛋白酶消化2 min 將細胞脫壁, 脫壁后的細胞液在1200 rpm 下離心5 min，再用5 mL 不同細胞相應的培養(yǎng)基重懸。重懸的MC3T3-E1 或C3H10T1/2 細胞懸液中含有的細胞數量用細胞計數板簡單計算，并用相應的培養(yǎng)基統(tǒng)一稀釋至2 × 105/mL 的數量濃度值，從而制備得到兩種不同細胞的標準細胞懸液，用以后續(xù)體外細胞支架的細胞接種步驟。經過嚴格高壓蒸汽滅菌30 min，四種不同結構的多孔體外細胞支架被放置于48 孔板中，在每個孔中加入不同細胞實驗實際所需細胞數相對應體積的標準細胞懸液，在細胞孵育培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2，飽和濕度環(huán)境）中孵育2 h，使得細胞初步沉降并貼附到支架上，通過上述步驟，即可完成體外細胞實驗前期細胞培養(yǎng)與接種的準備工作。
2.5.2 細胞增殖活性實驗
為了檢測 MC3T3-E1 和C3H10T1/2 細胞在四種不同結構的多孔體外細胞支架中的增殖活性差異，我們依次開展了活/死細胞（BestBio,BB-4126）染色實驗、細胞計數CCK-8（AbMole, M4839）染色實驗和FITC-phalloidin/DAPI （Yeasen, 40735ES75）染色實驗。在活/死細胞染色實驗中，首先將含有1 × 105 個MC3T3-E1 或C3H10T1/2 細胞的標準細胞懸液接種在四種不同結構的體外細胞支架上，再用相同的培養(yǎng)基繼續(xù)進行細胞培養(yǎng)，使接種在支架上的細胞將在支架表面持續(xù)擴增。實驗共設置三個實驗組，使MC3T3-E1 或C3H10T1/2 細胞在不同的支架上分別生長1、3、5 天，記為Day1、Day3、Day5 實驗組。不同組的實驗樣品（長有細胞的支架）用400 μL 溶液A （Calcein-AM，1:1000）浸泡處理30 min，將樣品表面的所有活細胞充分染色，再用400 μL 溶液B （PI，1:2000）浸泡處理2 min，將樣品表面的所有死細胞充分染色。A、B 溶液均用漢克斯平衡鹽溶液（HBSS）稀釋，染色過程中嚴格避光。染色完畢后用適量的磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕洗滌樣品2 次，將樣品轉移至倒置顯微鏡（Olympus）下進行觀察。為了進一步檢測細胞在四種不同結構的體外細胞支架上的具體增殖速率，我們采取了細胞計數CCK-8 染色實驗的方法。在CCK-8染色實驗中，將1 × 105 個MC3T3-E1 或C3H10T1/2 細胞接種在四種體外細胞支架上，并設置Day1、Day3、Day5 三個實驗組。培養(yǎng)了相應天數的實驗樣品分別浸于CCK-8 : HBSS 為1:10的混合溶液550μL 中，在細胞孵箱中避光反應2 h。反應后溶液的吸光度值（OD 值）通過分光光度儀精準測量，分光儀的激發(fā)波長值設置為550 nm，最終通過測得樣品的OD 值的大小，反映出不同時間點下樣品含有的細胞數目的多少，并對OD 值進行統(tǒng)一的標準化計算，得到兩種細胞在四種多孔支架上的增殖速率的高低差異。
通過上述兩項實驗，MC3T3-E1 和C3H10T1/2 細胞在四種不同結構的體外細胞支架表面存活與增殖情況得到了很好的驗證，但細胞在支架表面生長的形態(tài)狀況尚不明確，因此我們補充開展了FITCphalloidin/DAPI 染色實驗，希望明確多孔支架的四種結構對細胞形態(tài)可能造成的影響。同樣將1 × 105 個MC3T3-E1 或C3H10T1/2 細胞接種在四種體外細胞支架上，統(tǒng)一培養(yǎng)3 天，在第3 天收集實驗樣品，用300 μL 的4%多聚甲醛處理樣品10 min，將細胞殺死并固定細胞形態(tài)。固定后的樣品轉移入300 μL 的Triton X-100 溶液中，反應5 min，以提高固定細胞的細胞膜滲透性。二次處理后的樣品最終用FITCphalloidin的PBS 稀釋液（1:200）對細胞骨架進行染色30 min，接著用DAPI 的PBS 稀釋液（1:500）對細胞核進行染色5 min。染色過程中全程避光，以避免熒光染劑受光照而發(fā)生淬滅，影響樣品最終的顯色效果。染色完成的樣品轉移至倒置顯微鏡（Olympus） 下觀察和成像。
2.5.3 茜素紅染色實驗
茜素紅染色劑（Alizarin Red S）是骨科實驗中的一種常用的試劑，能特異性地結合鈣離子配體，產生深紅色的離子化合物，因此多用于成骨細胞胞外基質中的鈣結節(jié)沉積顯色。在茜素紅染色實驗中，首先將1 mL 的MC3T3-E1 標準細胞懸液（2 × 105 細胞）接種在四種不同結構的體外細胞支架上，靜置2h，待細胞沉降并粘附于支架表面，吸除普通的細胞培養(yǎng)基，改用成骨誘導培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)。成骨誘導培養(yǎng)基需提前配制，其成分是在細胞培養(yǎng)基DMEM 的基礎上，加入了50 mg/L 的維生素C、10 mmol/L 的β-甘油磷酸鈉以及10-8 mol/L的地塞米松。實驗共設置三個實驗組，對生長在不同支架上的MC3T3-E1 細胞進行成骨誘導培養(yǎng)4、7、14 天，分別記為Day4、Day7、Day14實驗組。將不同組別的實驗樣品用300 μL 的4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，然后用500 μL 茜素紅S 溶液（Beyotime, C0138）染色30min，使支架表面的鈣結節(jié)充分顯色。染色完成后，樣品用蒸餾水輕輕洗滌兩次，在空氣中干燥10 min，轉移至普通光學顯微鏡下觀察與攝像。為了進一步測量不同支架表面胞外基質鈣結節(jié)沉積的實際含量，將染色后的樣品依次浸泡在400 μL 10%質量濃度的氯化十六烷基吡啶溶液（CPC）中，在37℃下反應30 min，使得鈣結節(jié)沉積充分溶解在CPC 溶液中。CPC 溶液后續(xù)在分光光度儀中以562 nm 的激發(fā)波長檢測溶液的OD 值，用以代表MC3T3-E1 細胞在不同時間點所產生的細胞外鈣結節(jié)的沉積量。
2.5.4 堿性磷酸酶檢測
堿性磷酸酶（ALP）是成骨細胞內反映成骨代謝強弱的一個關鍵分子指標，其在細胞內的活性強弱能直接體現細胞的成骨狀態(tài)與成骨功能的高低，因此本實驗通過檢測MC3T3-E1 細胞在四種不同結構的細胞支架內生長時細胞內部ALP活性的實際差異，側面證明不同的多孔結構對成骨代謝帶來的潛在影響。將1 mL MC3T3-E1 標準細胞懸液（含2×105 細胞）接種在四種不同結構的體外細胞支架上，靜置2h 待細胞在支架上初步粘附，更換成骨誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 天和14 天，分別記為Day7 與Day14 實驗組。在相應的時間點，收集得到的各組樣品，用500μL 的RIPA 裂解緩沖液（Beyotime, P0013K）將支架表面細胞徹底裂解，提取出四種支架上生長了7天或14天的MC3T3-E1細胞的所有蛋白。采用ALP檢測試劑盒（Beyotime,P0321M），定量分析各樣品裂解液中的總ALP活性，將蛋白液樣品與顯色底物按1:1比例混合搖勻，在37℃下孵育30 min，再加入混合液等體積的反應終止液，于分光光度儀中以405nm 的激發(fā)波長檢測溶液的OD值，參照說明書標準曲線計算得到樣品的ALP活性值，單位記為U。為了消除不同樣品之間因蛋白質總含量不同造成的潛在干擾，因此再次重復上述細胞接種與和培養(yǎng)過程，取200 μL RIPA 裂解液提取生長在四種支架上的MC3T3-E1 細胞的所有蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒（Beyotime, P0012）分析總蛋白含量，將A 液與B 液提前以50:1 比例混合配制工作液，工作液再以10 倍于蛋白液的比例與蛋白液混合均勻，室溫下孵育2 h，在分光光度儀中以562 nm 的激發(fā)波長檢測溶液的OD 值，參照說明書標準曲線計算得到樣品的蛋白含量，單位記為mg。用總ALP 活性值除以總蛋白含量值，最終計算得到不同樣品的標準化ALP 活性，單位記為U/mg。
2.5.5 逆轉錄聚合酶鏈式反應實驗
在本實驗中，為了在基因表達的層面上反映MC3T3-E1 和C3H10T1/2 細胞在不同體外支架上的成骨與成肌腱/韌帶分化水平，開展了一系列針對成骨與成肌腱/韌帶分化基因表達水平檢測的逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）實驗。將含2 × 105個細胞的1 mL MC3T3-E1 或C3H10T1/2 標準細胞懸液接種在四種不同拓撲結構的體外細胞支架上，靜置2h 待細胞初步沉淀粘附后，更換成骨誘導培養(yǎng)基或成肌腱/韌帶培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 天和14 天，分別記為Day7 與Day14 實驗組。成骨培養(yǎng)基的成分同2.5.4 節(jié)中所述，成肌腱/韌帶培養(yǎng)基的成分則是在細胞培養(yǎng)基α-MEM 的基礎上，加入了1 mmol/L 的維生素C、0.04 mmol/L 的 L-脯氨酸以及10 μg/L 的成纖維細胞生長因子-2。實驗選用RNA 提取試劑盒（Solarbio, R1200）提取出了不同樣本的總RNA，使用每個樣本中1 μg 的總RNA，用于后續(xù)RNA 對應的cDNA的合成。實驗將提取得到的1 μg 的總RNA 用SureScript 試劑盒（GeneCopoeia, QP057）合成對應的一鏈cDNA，再將合成的一鏈cDNA 用BlazeTaq SYBR GREE 試劑盒（GeneCopoeia, QP033）進行聚合酶鏈式反應擴增，最后在BIO-RAD 熒光定量PCR 儀中分析出目的基因的熔融曲線及實際含量。在C3H10T1/2 細胞核內的基因譜中，我們選取了表達量穩(wěn)定的Rplp0 作為該細胞的內參基因，旨在衡量C3H10T1/2 細胞中成肌腱/韌帶關鍵基因Col1a1、SCX、DCN 的表達水平。在MC3T3-E1 細胞核內的基因譜中，我們則選取了表達量同樣相對穩(wěn)定的β-actin 作為該細胞的內參基因，用以衡量MC3T3-E1細胞中成骨關鍵基因ALP、OCN、OPN、Runx-2 的表達水平。實驗中用到的所有內參基因及目的基因的相關引物序列見表2.2，不同基因的最終表達水平結果采用delta-delta Ct 法（2-ΔΔCt）進行計算分析。
2.6 體內動物實驗除了上述的一系列體外細胞實驗，實驗計劃在此基礎上額外開展針對新西蘭白兔的體內動物實驗，以進一步分析四種拓撲微孔結構支架體內成骨能力的具體差異。體內實驗選取健康的成年雄性新西蘭白兔作為實驗對象，每個實驗組下劃分三只以得到三個重復樣品進行后續(xù)實驗分析，白兔的體重統(tǒng)一嚴格控制在3.0 ~ 3.5 kg 的范圍內。實驗過程中對所有白兔施以完全相同的手術操作，盡量避免因手術流程環(huán)節(jié)的差異對實驗結果造成潛在干擾。實驗采用10%鹽酸氯丙嗪，以0.2 mL/kg 的劑量對白兔肌肉注射麻醉，10 min 待白兔充分麻醉后，在兔下肢膝關節(jié)內側股骨端切一10 cm 切口，由淺入深逐層暴露兔的股骨內側髁，做好標記，并在冠狀面上統(tǒng)一水平鉆取一半徑為5.5 mm、深度為10 mm 的骨缺損隧道。在不同實驗組的白兔骨缺損隧道中相應植入四種不同的3D 打印體內動物支架，固定牢固后，將切開的軟組織用可吸收外科縫線逐層緊密縫合，待接下來4 ~ 8 周內，骨缺損逐漸愈合，骨組織在支架內持續(xù)長入。所有的手術操作均嚴格遵循臨床外科手術的原則，并全稱在無菌條件下進行，術后前三日內每日以105 U 的劑量對白兔施以青霉素肌肉注射，通過上述操作，防止白兔因手術創(chuàng)傷造成的感染與損耗，有利于骨缺損的愈合與骨組織的再生恢復。手術4 周或8 周后，在相應時間節(jié)點對實驗動物進行二氧化碳安樂死處理，收集得到先前植入了體內支架的股骨遠端骨塊標本，用4%多聚甲醛溶液充分浸泡固定，用于后續(xù)的樣品分析。實驗中涉及的所有程序與操作均嚴格遵循實驗倫理有關的法律、法規(guī)以及動物倫理學的學科規(guī)定，實驗經由吉林大學基礎醫(yī)學實驗教學中心的批準，批準文號為2023430。2.6.1 micro-CT 分析將先前收集得到的植有不同組別體內支架的股骨遠端骨塊樣品從多聚甲醛中取出，置于陰涼空氣中干燥10 min，轉移到micro-CT儀（Skyscan1076）進行micro-CT 掃描。掃描儀機器參數設置為電壓70 kV、電流141 μA、精確度12.6 μm。通過儀器掃描，生成了不同樣品的斷層掃描圖片，將圖片文件包導入CTVol （Version 2.0）軟件中，實現不同骨塊樣品的三維模型重建。在樣品的三維模型中，可以清晰顯示植入股骨遠端內部的金屬多孔支架，并顯示出支架周圍新生骨組織的分布情況?；谌S重建的模型數據，軟件能夠定量計算出支架周圍新生骨組織的成骨指標，包括BV/TV（骨體積分數，骨體積/骨缺損總體積）、Tb. Th（骨小梁厚度）、Tb. Sp（骨小梁分離度），Tb.N（骨小梁數量）和BS/TV（骨表面積密度，骨表面積/骨缺損總體積）。通過比較不同樣品的上述新生骨組織成骨指標，綜合反映出不同樣本的新生骨質量，從而體現不同的拓撲微孔結構支架對體內成骨的具體影響。2.6.2 組織切片分析重復 2.6 節(jié)中相同的實驗操作，得到4 周、8 周兩個時間點下分別植有不同類型體內支架的股骨遠端骨塊樣品，將浸泡固定于多聚甲醛中的股骨遠端標本再次取出，浸于100%的丙酮液中進行脫水處理，隨后將樣品包埋在聚甲基丙烯酸甲酯中。包埋樣品轉移至硬組織切片機（EXAKT300CP）中，將包埋組織切成300μm厚的組織切片，切割平面選取在股骨遠端冠狀面，切割面通過體內支架的縱軸，以充分顯示骨缺損內植入的支架和周圍骨組織再生情況。將組織切片依次行蘇木精-伊紅染色與甲苯胺藍染色，切片充分染色后轉移至共聚焦顯微鏡（LEICA TCS SPE）下觀察并成像，獲取不同切片的低倍視角（5×）、中倍視角（12.5×）、高倍視角（25×）圖像，在不同的放大視野下仔細觀察骨缺損愈合情況及體內支架周圍骨組織的再生情況。2.7 數據統(tǒng)計分析本實驗中所有實驗數據均采用 GraphPad Prism （Version 9.2）統(tǒng)計軟件進行數據分析，所有定量數據均以平均數±標準差（SD）的形式表示并繪制在相應統(tǒng)計圖表中。每個實驗組下分別設置有3 個重復樣品，不同實驗組結果數值采用獨立樣本t 檢驗和雙因素方差分析進行計算與分析，結果P < 0.05 則提示實驗結果的差異具有統(tǒng)計學的意義。3.1 應力分布模擬與支架打印圖 3.1A~3.1B 顯示了在Comsol 軟件中不同拓撲微孔結構的RVE模型以及對應的2 × 2 × 2 簡化支架模型。在進行有限元計算前，不同簡化支架模型的具體網格劃分如圖3.1C 所示。通過Comsol 軟件的有限元計算分析，四種簡化支架模型在5 × 107 MPa 垂直載荷下的von Mises 應力分布如圖3.1D 所示。圖中結果表明，四種結構的多孔支架均能夠承受較大的機械應力，機械應力在支架內部都能較為均勻地分布，因此四種拓撲結構被證明均具有優(yōu)良的機械強度性能。圖3.1E~3.1F 為通過EBM 3D 打印技術打印得到的四種拓撲微孔結構體外細胞支架和體內動物支架，打印結構表明EBM 3D 技術具有較高的打印精度，實際微孔拓撲結構的打印效果良好，所采用的打印機的打印過程穩(wěn)定，并沒有出現支架塌陷以及孔隙開裂等異常的打印狀況。3.2 材料結構表征與機械強度測試通過一系列的材料結構表征檢測，圖 3.2A-3.2B 顯示了Ti6Al4V球形粉末樣品和3D 打印的四種不同拓撲微孔結構體外支架的實際SEM 和EDS 圖像。利用EBM 3D 打印技術，成功制造出了所需的四種目標支架，相應的四種微拓撲結構的典型特征和細節(jié)通過該打印技術得到充分體現，且打印前后材料的主要構成元素基本不變，證實了EBM 打印技術的準確性和穩(wěn)定性很高，打印質量優(yōu)良。四種支架的表面粗糙度相同，這保證了四種支架在生物功能上差異主要是由于其自身不同的微拓撲結構造成，而不是由于其表面粗糙度的不同而造成（圖3.2A）。值得注意的是，通過EBM 3D 打印技術，原材料Ti6Al4V球形粉末中含有的少量碳雜質被消除，且不可避免地引入了微量的氮元素，這可能是由于EBM 打印過程中產生的高溫高能電子束造成的（圖3.2B）。一系列的機械強度測試結果顯示，與相同尺寸下的普通實體鈦合金螺釘相比，四種多孔拓撲結構的引入均顯著降低了支架整體的壓縮彈性模量和名義屈服強度。在此基礎上，這些多孔拓撲支架仍保留著足夠的機械強度，數據結果顯示，四種微孔結構的支架與天然骨組織的機械強度相當，并沒有因為自身的多孔化而損失骨植入物所需的基本機械性能（圖3.2C-3.2E）。3.3 體外細胞增殖實驗活/死細胞染色結果顯示（圖3.3A-3.3B），成骨細胞MC3T3-E1和胚胎成纖維細胞C3H10T1/2 均能在四種支架表面附著并持續(xù)增殖，該結果表明四種支架在體外具有實際的骨與肌腱/韌帶細胞親和能力。在接種后的5天內，MC3T3-E1 和C3H10T1/2 細胞持續(xù)增殖，兩種細胞在第3 ~ 5 天的增殖速度較第1 ~ 3 天明顯加快，且在接種后的5天內基本不發(fā)生細胞的死亡，在顯微鏡視野下相較于活細胞基本上觀察不到死細胞，這進一步印證了四種支架均具有理想的生物相容性。為了進一步檢測出 MC3T3-E1 和C3H10T1/2 細胞在這四種不同拓撲微孔結構支架中的各自的細胞增殖速率，我們在活/死細胞染色實驗基礎上繼續(xù)進行了CCK-8 染色實驗（圖3.3C-3.3D 所示）。在第3天時，四個實驗組支架內的MC3T3-E1 細胞增殖速率并沒有明顯統(tǒng)計學差異，四個組的增殖速率結果在此時均處于低值范圍內。培養(yǎng)至第5天時，MC3T3-E1 細胞的增殖速率顯著增加，其中以Fischer-KochS 組、Octet 組和Diamond 組增長最為明顯。與Double Gyroid 組相比，Fischer-Koch S 組、Octet 組和Diamond 組的MC3T3-E1 細胞增殖速率達到了更高的數值水平（圖3.3C）。有所不同的是，對于接種在四種多孔支架上的C3H10T1/2 細胞，在第3 天和第5 天的增殖速率值均顯示具有明顯的統(tǒng)計學差異。在這兩個時間點，四個實驗組支架內的C3H10T1/2 細胞顯示出比較相似的增殖速率差異，Fischer-Koch S 組、Octet 組和Double Gyroid 組的C3H10T1/2 增殖速率大大高于Diamond 組，其中又以Fischer-Koch S 組和Double Gyroid 組更為顯著（圖3.3D）。 
通過上述活/死細胞染色實驗與CCK-8 染色實驗，成功揭示出了四種不同的拓撲微孔結構設計對成骨、成肌腱/韌帶細胞增殖率的影響。為了進一步揭示四種不同的拓撲微孔結構設計對成骨、成肌腱/韌帶細胞生長形態(tài)造成的潛在影響， 我們繼續(xù)進行了FITCphalloidin/DAPI 染色實驗。通過該熒光染色實驗，生長在四種不同支架上的MC3T3-E1 和C3H10T1/2 細胞的細胞骨架與細胞核得到了清晰的顯影（圖3.3E-3.3F）。實驗結果顯示，當MC3T3-E1 細胞在Fischer-Koch S 支架和Double Gyroid 支架中生長時，細胞之間相互接觸和連接的細胞骨架更為豐富，因此Fischer-Koch S 和Double Gyroid 這兩種多孔結構在促進MC3T3-E1 細胞的遷移與延展上顯示出獨特的生物功效。此外，當C3H10T1/2 細胞在Fischer-Koch S、Octet 和Double Gyroid 支架中生長時，細胞顯示出更大的體積，細胞的形態(tài)更為伸展；與之相比的是，當C3H10T1/2 細胞在Diamond 支架中生長時，細胞表現出相對明顯的細胞皺縮和相對較差的細胞延展現象。因此，為了進一步提高C3H10T1/2 細胞在多孔支架內生長時的骨架延展和細胞遷移能力，最好采用Fischer-Koch S, Octet 或Double Gyroid 結構，而并不推薦采用性能較弱的Diamond 結構。3.4 體外茜素紅染色實驗本實驗通過茜素紅溶液的體外染色，分析了MC3T3-E1 細胞在四種不同拓撲微孔結構支架中所產生的細胞胞外基質鈣結節(jié)沉積含量，用以衡量MC3T3-E1 成骨細胞在不同支架內的成骨活性的高低差異（圖3.4A-3.4B）。最終各實驗組CPC 溶液的OD 值顯示，在成骨分化培養(yǎng)的第1 周內，四種支架內的產生的胞外鈣沉積含量均較低，無明顯統(tǒng)計學上的差異；在成骨分化培養(yǎng)的第1 ~ 2 周，四種支架內胞外鈣沉積含量顯著增加。與Octet 組相比，Fischer-Koch S 組、Diamond組和Double Gyroid 組均產生了更多的細胞外鈣沉積，因此這三種結構下的多孔支架被認為更有利于成骨細胞胞外鈣沉積的生成與分泌。3.5 體外堿性磷酸酶檢測為了檢測 MC3T3-E1 細胞在四種不同拓撲微孔結構支架中的成骨代謝差異，用以反映不同支架拓撲結構對細胞成骨狀態(tài)的潛在影響，本實驗分別檢測了四個實驗組在不同時間節(jié)點下的ALP 活性。實驗結果顯示，在第7 天時，Fischer-Koch S 組、Diamond 組和Double Gyroid 組MC3T3-E1 細胞的ALP 活性值相對較高，此時四個實驗組中Fischer-Koch S 組的ALP 活性值最高，Octet 組的ALP 活性值最低。在第14 天時，Fischer-Koch S 組和Diamond 組ALP 活性值較高，這時Diamond 組ALP 活性值最高，Octet 組ALP 活性值最低。從第7天到第14天，四個實驗組的ALP 活性值整體均表現出輕微的下降趨勢，然而四組中Fischer-Koch S 組和Diamond 組ALP 活性值始終保持在較高的水平，而Octet 組ALP 活性值始終保持在四組支架中的最低水平（圖3.4C）。3.6 體外 RT-PCR 實驗通過在 2.5.5 節(jié)中介紹的RT-PCR 檢測步驟，本實驗最終在細胞基因表達的水平上反映了MC3T3-E1 和C3H10T1/2 細胞在四種不同拓撲微孔結構支架中的成骨與成肌腱/韌帶分化水平。針對MC3T3-E1細胞，實驗選取了四個經典的成骨分化相關基因：ALP、OCN、OPN、Runx-2，并檢測了這幾種基因在MC3T3-E1 細胞內部不同時間點下的表達水平（圖3.5A）。結果顯示，ALP 基因和Runx-2 基因在FischerKoch S 組、Diamond 組和Double Gyroid 組細胞中的表達水平相對較高。同時，在四個實驗組別中，OCN 基因和OPN 基因在Fischer-Koch S 組細胞中的表達水平較高。從第7 天到第14 天，OCN 基因和OPN基因的表達水平總體呈現上升的趨勢，而ALP 基因和Runx-2 基因的表達水平總體呈現下降的趨勢。值得注意的是，四個成骨相關目標基因的表達水平在Octet 組細胞中均表現為最低，提示Octet 結構對細胞成骨分化的促進效果可能最為微弱。圖 3.5B 描述了生長在四種不同微孔結構支架上的C3H10T1/2 細胞內肌腱/韌帶分化相關基因在不同時間點下的表達水平，針對C3H10T1/2 細胞，實驗選取了三個經典的成肌腱/韌帶分化相關基因：Col1a1、SCX、DCN。實驗結果顯示，Col1a1 基因和DCN 基因在Octet組細胞中的表達水平較高，SCX 基因在Octet 組和Double Gyroid 組細胞中的表達水平較高。從第7 天到第14 天，Col1a1、SCX 和DCN基因的總體表達水平呈現上升的趨勢。在所有的實驗組中，三個成肌腱/韌帶分化相關基因的表達水平在Fischer-Koch S 組細胞中均處于最低值，提示Fischer-Koch S 結構在提升細胞內肌腱/韌帶分化水平方面的生物功能較為不足。3.7 體內 micro-CT 分析利用 micro-CT 技術，本實驗通過對分別植有四種不同微孔結構體內支架的股骨遠端骨塊樣品進行全面掃描，最終完整生成了這四種支架在股骨內側髁骨缺損內的三維重建圖像，圖像詳細顯示了不同骨塊樣品相應骨缺損內新生骨組織的分布情況（圖3.6A）。新生骨組織為圖中顯示的黃色區(qū)域，金屬支架為圖中顯示的灰色區(qū)域，結果表明在多孔支架植入之后，骨缺損內新生骨組織在多孔支架的周圍不斷地修復再生，部分新生骨組織顯示已經成功地生長并滲入了支架的孔隙中。在此基礎上，實驗逐一分析計算了四個實驗組之間新生骨組織成骨指標：BV/TV、Tb. Th、Tb. Sp、Tb. N 與BS/TV（圖3.6B）。BV/TV和Tb. Th 指標分別用以測量新生骨組織骨小梁的總體積和平均厚度，結果顯示，這兩個指標在Fischer-Koch S 組、Diamond 組和Double Gyroid 組中的數值相對較高，而在這三個實驗組中，上述兩項指標在Fischer-Koch S 組和Diamond 組中的提升尤為顯著，這說明這兩種多孔結構較其他結構在體內能誘導產生更多的骨組織的再生。Tb. Sp 成骨指標代表著新骨小梁間髓腔間隙的平均寬度值，該指標在Fischer-Koch S 組、Diamond 組和Double Gyroid 組中均較低，其中Fischer-Koch S 組數值最低。Tb. N 成骨指標表示平均每毫米內新生骨組織的骨小梁數量，而BS/TV 成骨指標表示新生骨小梁的總表面積。Tb. N 和BS/TV 值在Fischer-Koch S 組、Diamond 組和Double Gyroid 組中相對較高，其中以Fischer-Koch S 組的數值最高。結合上述Tb. Sp、Tb. N 與BS/TV 三個成骨指標結果，實驗提示Fischer-Koch S、Diamond 和Double Gyroid 結構均能在骨缺損的體內環(huán)境誘導產生更為致密與表面積更大的新生骨組織，其成骨功效比較顯著。3.8 體內組織切片分析本實驗利用硬組織切片技術，對植入有四種不同微孔結構體內支架的股骨遠端骨塊樣品逐一進行了進行了蘇木精-伊紅染色與甲苯胺藍染色，從而在組織學層面對植入了支架的骨缺損內部及支架周圍的新生骨組織進行了染色分析。圖3.7A 為四個實驗組實驗樣品的蘇木精-伊紅染色結果，染色切片中紅色區(qū)域表示為骨缺損內新生的膠原結締組織，其主要是由新生的骨組織和新生的軟骨組織構成。為了進一步探究上述膠原結締組織的具體組織構成，本實驗對骨塊的切片樣品繼續(xù)進行了甲苯胺藍染色（圖3.7B），該染色切片中淺藍色或深藍色區(qū)域代表著新生的骨組織，紅紫色區(qū)域則代表著新生的軟骨組織。根據上述組織切片的染色結果分析證明，不同實驗樣品骨缺損內新生的膠原結締組織幾乎全部是由新生骨組織組成的，僅僅在Fischer-Koch S 組和Double Gyroid 組樣品的染色切片中可見到少量的新生軟骨組織成分。在四個實驗組中，Fischer-Koch S 組、Diamond 組和Double Gyroid 組的支架周圍顯示有更多的新生骨組織形成，并且再生的骨組織與這三種支架之間接觸結合得相對較為緊密。除此之外，四個實驗組的組織切片中均未見到有明顯的炎性組織存在，這表明這四種支架均具有良好的生物相容性，在植入動物體內的骨組織環(huán)境后內并不會表現出明顯的組織異質性，不會激發(fā)出組織周圍明顯的免疫炎癥反應。當多孔支架植入了骨缺損8 周后，Fischer-Koch S 組、Diamond 組和Double Gyroid 組支架周圍均可見到典型的哈弗氏骨結構，這進一步證明了這三種類型的多孔支架在促進新生骨組織的成熟方面具有一定的優(yōu)勢。 
鈦合金（Ti6Al4V）螺釘由于鈦金屬材料自身具備著優(yōu)良的機械強度和生物相容性，是常見的骨科金屬植入物之一，在臨床中可以被用在重建肌腱/韌帶的手術之中[50-52]。傳統(tǒng)的鈦合金螺釘通常采用著簡單的實心設計，因此不可避免地會產生應力屏蔽現象和術后松動問題[16, 17]。為了有效改善上述問題，本實驗在傳統(tǒng)的實心鈦合金螺釘內部引入了額外的多孔化拓撲結構，使得螺釘整體的彈性模量大大降低，進而有效地避免了應力屏蔽現象的發(fā)生。此外，多孔結構的引入為螺釘提供了更多的內部孔隙空間，使得肌腱/韌帶重建部位新生的骨組織和肌腱/韌帶組織能夠逐漸長入螺釘的孔隙之中并與螺釘之間產生更為緊密的組織整合，進而顯著地提高螺釘體內植入術后的長期固定效果。為了篩選出足夠理想的多孔拓撲結構，從而盡可能地提高鈦合金螺釘的成骨和成肌腱/韌帶生物性能，我們初步選擇了四種經典的增材制造拓撲微孔結構設計（Fischer-Koch S、Octet、Diamond 和Double Gyroid），并將其引入到實心鈦合金支架中，以進行后續(xù)的相關體內外生物學研究。本實驗利用EBM 3D 打印技術，成功制造出了這四種經拓撲結構優(yōu)化設計的多孔生物支架，并利用打印所得到的支架，開展了一系列體外和體內實驗。通過上述一系列的體內外生物實驗的反復驗證，本研究充分揭示了鈦合金螺釘內部不同的拓撲結構對骨和肌腱/韌帶再生可能造成的潛在影響，為鈦合金螺釘未來的拓撲優(yōu)化提供了一些新的方案，以更好地貼合于肌腱/韌帶的螺釘重建這一特殊的臨床情景。為了比較四種增材制造拓撲微孔結構下的多孔鈦合金支架在骨再生能力上的差異，我們詳細檢測了生長在這些支架中的成骨細胞（MC3T3-E1）的增殖代謝活性和成骨分化活性?；?死細胞染色和CCK-8 染色實驗結果表明，成骨細胞在Fischer-Koch S 支架中增殖速率得到顯著提升。此外，FITC-phalloidin/DAPI 染色實驗結果表明，成骨細胞在Fischer-Koch S 和Double Gyroid 支架中生長時能產生更豐富的細胞骨架，呈現出更為伸展的細胞形態(tài)，這表明上述兩種結構可以明顯改善成骨細胞的遷移和浸潤能力。通過這三個細胞增殖活性實驗的綜合分析，研究證明Fischer-Koch S 結構在提升成骨細胞的增殖能力上效果最為突出。除了細胞增殖活性實驗，本研究還開展了茜素紅染色實驗、ALP 染色實驗和RT-PCR 實驗，對四多孔種支架中成骨細胞的胞外鈣結節(jié)沉積、胞內ALP 活性和成骨分化相關基因（ALP、OCN、OPN、Runx-2）表達水平逐一進行了檢測，用以揭示四種結構的多孔支架對于成骨細胞成骨分化方面可能產生的影響。Runx-2 基因是成骨分化的一個關鍵調控因子，它能夠上調許多其他下游的成骨分化相關基因，包括ALP、OPN 和OCN 等基因[53, 54]。ALP 是成骨細胞內存在的一種關鍵的蛋白酶，它能夠水解焦磷酸（一種能抑制羥基磷灰石形成的胞內物質），并生成大量的磷酸鹽。磷酸鹽是生成羥基磷灰石的關鍵底物，當生成的磷酸鹽與鈣離子結合，便不斷形成新的羥基磷灰石晶體（骨基質的主要成分）[55]。新形成的羥基磷灰石晶體隨后會受到OPN 和OCN 共同的調節(jié)和重塑，從而促進羥基磷灰石晶體最終的成熟[56-61]。因此，以上這四個成骨基因在細胞的成骨分化過程中起著至關重要的作用，它們是探測細胞成骨分化水平高低的關鍵靶點。本研究通過上述一系列成骨分化相關的檢測實驗，發(fā)現Fischer-Koch S 支架、Diamond 支架和Double Gyroid 支架能誘導成骨細胞分泌產生更多的胞外鈣結節(jié)沉積，同時能夠顯著提升成骨細胞胞內ALP活性水平。在成骨分化基因的表達水平方面，結果表明Runx-2 基因在Fischer-Koch S 組、Diamond 組和Double Gyroid 組細胞中表達水平較高；OCN 基因和OPN 基因在Fischer-Koch S 組細胞中表達水平較高；ALP 基因同樣在Fischer-Koch S 組、Diamond 組和Double Gyroid組細胞中表達水平較高。除了上述的體外細胞實驗，本研究還額外開展了家兔的體內動物實驗，體內micro-CT 分析和組織切片分析結果表明，Fischer-Koch S、Diamond 和Double Gyroid 支架具有更強的體內骨再生誘導能力。綜合分析本研究所開展的體內外生物實驗，可以發(fā)現Fischer-Koch S、Diamond 和Double Gyroid 多孔結構對提升細胞或組織的成骨再生能力效果突出，其中又以Fischer-Koch S 支架的功效最為突出，Fischer-Koch S 支架幾乎在各個實驗結果中都表現出了優(yōu)良的促成骨能力。因此研究證明，Fischer-Koch S 結構在這四種拓撲結構中最適合用于提升多孔鈦支架的骨再生能力。在這四種結構中，該結構在促進骨再生方面的生物學效應最為廣泛，并且促成骨功能在這四種拓撲結構中表現得最為穩(wěn)定。除此之外，我們還繼續(xù)探究了成纖維細胞（C3H10T1/2）在四種多孔鈦合金支架中的增殖活性和肌腱/韌帶分化能力的差異，希望能夠比較得到這四種多孔鈦支架在促進肌腱/韌帶再生方面的性能差異。FITC-phalloidin/DAPI 染色實驗結果顯示，豐富的細胞骨架和延伸的細胞形態(tài)僅于Fischer-Koch S 組、Octet 組和Double Gyroid 組中觀察到，這相較于這三種結構，Diamond 型支架中生長的成纖維細胞遷移和浸潤能力較差?；?死細胞染色和CCK-8 染色實驗結果顯示，成纖維細胞在Fischer-Koch S 組、Octet 組和Double Gyroid 組中增殖生長地較快。這些實驗可以表明，我們能夠初步篩選出Fischer-Koch S、Octet 和Double Gyroid 結構，用來進一步提升多孔支架中成纖維細胞的生長與增殖活性。此外，我們開展了相應的RT-PCR 實驗，檢測了四種多孔支架中成纖維細胞的肌腱/韌帶分化相關基因（Col1a1、DCN、SCX）的表達水平。Col1a1 基因的功能是編碼合成膠原前體α1(I)肽鏈，它是進一步合成I 型膠原大分子的重要前體物質[62]。I 型膠原是肌腱/韌帶組織中最主要的細胞外基質成分。因此，Col1a1 基因的表達水平可以用來反映受損肌腱/韌帶組織內的再生程度[63-65]。DCN 是富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖（Small Leucine-rich Proteoglycan, SLRP）其中的一個代表分子，它在膠原纖維的組裝和交聯中起到至關重要的作用[66]。DCN 表達越高，再生的肌腱/韌帶組織就會越加堅韌[67, 68]。此外，SCX 是堿性螺旋-環(huán)-螺旋（Basic Helix-loop-helix, bHLH）家族中的一個重要的轉錄因子，一般存在于肌腱/韌帶組織中，對肌腱/韌帶組織的延伸和成熟具有調節(jié)的作用[69-71]。因此，Col1a1、DCN、SCX 這三個基因是檢測肌腱/韌帶分化水平的關鍵靶點。本研究通過實驗最終發(fā)現，Col1a1 基因和DCN 基因在Octet 支架組的成纖維細胞內表達水平較高，且SCX 基因在Octet 和Double Gyroid 支架組的成纖維細胞內表達水平較高。因此，Octet 結構被認為在提升支架的促肌腱/韌帶再生能力方面是這四種多孔支架中效果最為突出的，該結構在提升肌腱/韌帶組織的再生與分化上效果最為廣泛與穩(wěn)定。由此我們可以得出，鈦合金支架中Fischer-Koch S、Octet、Diamond和Double Gyroid 四種不同的多孔拓撲結構對骨和肌腱/韌帶的再生能產生一定的影響，四種不同支架的成骨與成肌腱/韌帶性能具有一定的差異。Fischer-Koch S 結構對促進骨組織再生的效果較好，而Octet結構對肌腱/韌帶組織再生的效果最好。因此，我們認為應用于肌腱/韌帶重建這一臨床情景中的鈦合金螺釘最好設計成Fischer-Koch SOctet雙層復合結構。螺釘的主體部分主要和骨組織相互接觸，因此主體部分應該設計成Fischer-Koch S 結構；螺釘和原位嵌入固定的斷裂肌腱/韌帶末端相互接觸的部分則應該設計成Octet 結構，這部分結構占螺釘總體的長度比例大致應由固定的斷裂肌腱/韌帶末端在骨隧道內的長度而確定。鈦合金螺釘除了應用于上述肌腱/韌帶重建的情景外，在臨床中還廣泛應用于其他類型的骨科手術中，如骨折的螺釘內固定、釘棒固定系統(tǒng)的植入、牙修復體的植入等[72-74]。在這些臨床情景中，傳統(tǒng)的實心鈦合金螺釘同樣會造成應力屏蔽現象與術后螺釘的松動問題，因此也應該采用多孔的整體設計替代傳統(tǒng)的簡單實心設計，在這些臨床情景中，我們同樣可以在螺釘并引入Fischer-Koch S 的多孔結構，從而提高螺釘的成骨性能，誘導更多的新生骨組織再生并與產生更緊密的整合，進一步提高其長期的固定效果。除了上述螺釘，Fischer-Koch S 結構還可以應用于其他類型的骨科植入物中，包括下頜骨重建中的缺損植入物、人工骨板植入物以及椎間盤切除術中使用到的椎間融合器等[75]。這些螺釘和植入物可以使用鈦合金材料和EBM 3D 技術制造，也可以采取其他的金屬材料（如鎂、鋅等），高分子聚合物材料(如聚乙醇酸、聚醚醚酮等），或者采用其他類型的打印制造技術（如選擇性激光燒結技術、立體光刻設備技術等）來進行打印與制造。只有最終在這些植入物中引入了Fischer-Koch S 的超材料多孔結構，植入物的綜合成骨能力將會得到顯著地提升。與 Octet 結構相比，Fischer-Koch S、Diamond 和Double Gyroid結構在促進骨組織再生方面效果整體上更為顯著，這三種結構均屬于TPMS 結構范疇。TPMS 結構的典型特征是表面平均曲率為零，不存在表面自交[37, 76]，這種特殊的結構特征可能是造成其自身具有優(yōu)良骨組織再生能力的潛在原因。Octet 是一種經典的原型拓撲結構，它的內部主體是由一個個的三角形結構組成，內部相鄰的梁柱彼此是以45°的角度而相互交錯[39, 40]。這種結構在促進骨組織再生方面可能優(yōu)勢不明顯，但在促進肌腱/韌帶組織再生和分化方面優(yōu)勢比較突出。因此我們可以將Fischer-Koch S 和Octet 結構綜合應用于肌腱/韌帶重建的鈦合金螺釘中，將螺釘大致設計成一個雙層的復合結構，植入后與骨組織相接觸的部分設計成Fischer-Koch S 結構，而與肌腱/韌帶組織接觸的部分設計成Octet 結構。這種Fischer-Koch S-Octet 雙層多孔螺釘最終將發(fā)揮類似于自體腱端組織（天然肌腱/韌帶中的關鍵組織區(qū)域）的橋接功能，從而將硬組織（骨）和軟組織（肌腱/韌帶）成功地連接起來。自體腱端組織是肌腱/韌帶組織中的多層結締組織區(qū)，具有典型的肌腱/韌帶-軟骨-骨的三層過渡結構[65]。因此，對于螺釘優(yōu)化的雙層多孔設計，我們未來還可以基于該設計做進一步的優(yōu)化，可以在Fischer-Koch S-Octet 這兩層之間添加一個額外的多孔層，來促進軟骨組織再生，從而模擬出天然腱端組織的肌腱/韌帶固定效果。因此，Fischer-Koch S、Diamond 和Double Gyroid 這四種多孔結構的成軟骨性能有待進一步開展相關實驗進行比較，從而篩選出促軟骨再生優(yōu)勢最顯著的一種，并應用于肌腱/韌帶重建的鈦合金螺釘中，相信能夠在雙層設計基礎上進一步提升螺釘對肌腱/韌帶的重建與固定效果。除了本文涉及到的四種多孔結構，增材制造拓撲優(yōu)化的研究領域內還存在著許多其他種類的多孔結構，如Schwarz P 結構[77, 78]，F-RD 結構[79, 80]與I-WP結構等[81, 82]，這些結構同樣具有優(yōu)秀的機械性能，但其在促進人體組織再生方面的功能仍有待進一步的發(fā)掘與研究，因此，這些相關結構下的多孔植入物在骨科臨床中的應用也將成為日后研究的一大熱點。 
多孔結構設計的螺釘更有利于肌腱/韌帶的重建，能夠顯著提高螺釘植入后的長期固定效果。多孔結構的引入，使得螺釘彈性模量降低到小梁骨組織的合理值范圍內，從而有效避免應力屏蔽問題。研究初步驗證了四種經典的增材制造多孔設計（Fisher - koch S, Octet,Diamond, Double Gyroid），在這四種結構中，Fischer-Koch S 結構更有利于骨再生，Octet 結構更適合改善肌腱/韌帶再生，因此提出Fisher- koch S-Octet 兩層結構的構想，可用于肌腱/韌帶重建螺釘的拓撲優(yōu)化，以提高其植入術后長期的固定效果。 [1] A. Gautieri, S. Vesentini, A. Redaelli, M.J. Buehler, Hierarchical Structure and Nanomechanics of Collagen Microfibrils from the Atomistic Scale Up, Nano Lett. 11(2) (2011) 757-766.[2] P. Kannus, Structure of the tendon connective tissue, Scand. J. Med. Sci. Sports 10(6) (2000) 312-320.[3] J. Kastelic, A. Galeski, E. Baer, The multicomposite structure of tendon, Connective tissue research 6(1) (1978) 11-23.[4] S.P. Reese, S.A. Maas, J.A. Weiss, Micromechanical models of helical superstructures in ligament and tendon fibers predict large Poisson's ratios, Journal of Biomechanics 43(7) (2010) 1394-1400.[5] J. Fallon, F.T. Blevins, K. Vogel, J. Trotter, Functional morphology of the supraspinatus tendon, J. Orthop. Res. 20(5) (2002) 920-926.[6] G.P. Hess, W.L. Cappiello, R.M. Poole, S.C. Hunter, Prevention and treatment of overuse tendon injuries, Sports medicine (Auckland, N.Z.) 8(6) (1989) 371-84.[7] H. Karimi, K. Seyed-Forootan, A.-M. Karimi, Stem Cells and Tendon Regeneration, in: D. Duscher, M.A. Shiffman (Eds.), Regenerative Medicine and Plastic Surgery: Skin and Soft Tissue, Bone, Cartilage, Muscle, Tendon and Nerves, Springer International Publishing, Cham, 2019, pp. 369-384.[8] F. Tencone, S. Della Villa, A. Giannini, Conservative Treatments for Tendinopathy, in: G.L. Canata, P. d'Hooghe, K.J. Hunt (Eds.), Muscle and Tendon Injuries: Evaluation and Management, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, 2017, pp. 157-174.[9] J.B. Tang, Tendon injuries across the world: Treatment, Injury-Int. J. Care Inj. 37(11) (2006) 1036-1042.[10] D.E. Birk, E. Zycband, Assembly of the tendon extracellular matrix during development, Journal of anatomy 184 ( Pt 3) (1994) 457-63.[11] R. Strocchi, V. De Pasquale, S. Guizzardi, P. Govoni, A. Facchini, M. Raspanti, M. Girolami, S. Giannini, Human Achilles tendon:morphological and morphometric variations as a function of age, Foot & ankle 12(2) (1991) 100-4.[12] M. Oberst, G. Konrad, G.W. Herget, A. El Tayeh, N.P. Suedkamp, Novel endoscopic sacroiliac screw removal technique: reduction of intraoperative radiation exposure, Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery 134(11) (2014) 1557-1560.[13] D. Sch?negg, A. Koch, G.T. Müller, M. Blumer, M.E.H. Wagner, Twoscrew osteosynthesis of the mandibular condylar head with different screw materials: a finite element analysis, Computer Methods in Biomechanics and Biomedical Engineering (2023).[14] J.H. Oh, Y.S. Kim, J.Y. Lim, B.H. Choi, Stress Distribution on the Prosthetic Screws in the All-on-4 Concept: A Three-Dimensional Finite Element Analysis, Journal of Oral Implantology 46(1) (2020) 3-12.[15] Y. Hirai, K. Watanabe, T. Deguchi, K. Ueda, K. Hamada, E. Tanaka, Influence of insertion depth on stress distribution in orthodontic miniscrew and the surrounding bone by finite element analysis, Dental Materials Journal 40(5) (2021) 1270-1276.[16] K. Haase, G. Rouhi, Prediction of stress shielding around an orthopedic screw: Using stress and strain energy density as mechanical stimuli, Computers in Biology and Medicine 43(11) (2013) 1748-1757.[17] S. Kuroda, Y. Nishii, S. Okano, K. Sueishi, Stress distribution in the mini-screw and alveolar bone during orthodontic treatment: a finite element study analysis, Journal of orthodontics 41(4) (2014) 275-84.[18] M. Torabi, S. Khorramymehr, M. Nikkhoo, M. Rostami, The role of orthopedic screws threads properties on the success of femoral fracture fixation, Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers Part CJournal of Mechanical Engineering Science 236(17) (2022) 9419-9430.[19] M. Be'ery-Lipperman, A. Gefen, A method of quantification of stress shielding in the proximal femur using hierarchical computational modeling, Computer methods in biomechanics and biomedical engineering 9(1) (2006) 35-44.[20] S.H. Naidu, Interference Screw Failure in Distal Biceps Endobutton Repair: Case Report, Journal of Hand Surgery-American Volume 35A(9)(2010) 1510-1512.[21] A. Persson, T. Gifstad, M. Lind, L. Engebretsen, K. Fjeldsgaard, J.O. Drogset, M. Forssblad, B. Espehaug, A.B. Kjellsen, J.M. Fevang, Graft fixation influences revision risk after ACL reconstruction with hamstring tendon autografts: A study of 38,666 patients from the Scandinavian knee ligament registries 2004-2011, Acta Orthopaedica 89(2) (2018) 204-210.[22] K. Shyam, P.B. Thippeswamy, S.R. Sundararajan, S. Rajasekaran, Peek screw displacement after PCL reconstruction: A radiographic red herring solved by MRI, Journal of Radiology Case Reports 16(5) (2022)10-16.[23] D. Wu, P. Isaksson, S.J. Ferguson, C. Persson, Young's modulus of trabecular bone at the tissue level: A review, Acta Biomaterialia 78 (2018)1-12.[24] A.C. Jones, C.H. Arns, A.P. Sheppard, D.W. Hutmacher, B.K. Milthorpe, M.A. Knackstedt, Assessment of bone ingrowth into porous biomaterials using MICRO-CT, Biomaterials 28(15) (2007) 2491-2504.[25] C. Wu, J.G. Fang, A. Entezari, G.Y. Sun, M.V. Swain, Y.N. Xu, G.P. Steven, Q. Li, A time-dependent mechanobiology-based topology optimization to enhance bone growth in tissue scaffolds, Journal of Biomechanics 117 (2021).[26] H. Tiainen, J.C. Wohlfahrt, A. Verket, S.P. Lyngstadaas, H.J. Haugen, Bone formation in TiO<sub>2</sub> bone scaffolds in extraction sockets of minipigs, Acta Biomaterialia 8(6) (2012) 2384-2391.[27] J. Li, X.L. Cui, G.J. Hooper, K.S. Lim, T.B.F. Woodfield, Rational design, bio-functionalization and biological performance of hybrid additive manufactured titanium implants for orthopaedic applications: A review, J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 105 (2020) 18.[28] H.J. Cao, L.F. Feng, Z.X. Wu, W.T. Hou, S.J. Li, Y.L. Hao, L. Wu, Effect of low-intensity pulsed ultrasound on the biological behavior of osteoblasts on porous titanium alloy scaffolds: An in vitro and in vivo study, Mater. Sci. Eng. C-Mater. Biol. Appl. 80 (2017) 7-17.[29] Y.S. Cho, J.S. Lee, M.W. Hong, S.H. Lee, Y.Y. Kim, Y.S. Cho, Comparative Assessment of the Ability of Dual-Pore Structure and Hydroxyapatite to Enhance the Proliferation of Osteoblast-Like Cells in Well-Interconnected Scaffolds, Int. J. Precis. Eng. Manuf. 19(4) (2018) 605-612.[30] Q. Zhang, H.X. Lu, N. Kawazoe, G.P. Chen, Preparation of collagen scaffolds with controlled pore structures and improved mechanical property for cartilage tissue engineering, J. Bioact. Compat. Polym. 28(5)(2013) 426-438.[31] X.M. Shi, A. Nommeots-Nomm, N.M. Todd, A. Devlin-Mullin, H. Geng, P.D. Lee, C.A. Mitchell, J.R. Jones, Bioactive glass scaffold architectures regulate patterning of bone regeneration <i>in vivo</i>, Appl. Mater. Today 20 (2020) 11.[32] H. Zhu, M. Li, X.L. Huang, D.H. Qi, L.P. Nogueira, X. Yuan, W.B. Liu, Z.H. Lei, J.W. Jiang, H.L. Dai, J. Xiao, 3D printed tricalcium phosphate-bioglass scaffold with gyroid structure enhance bone ingrowth in challenging bone defect treatment, Appl. Mater. Today 25 (2021) 15.[33] C.N. Sun, E.C. Dong, J.Y. Chen, J.B. Zheng, J.F. Kang, Z.M. Jin, C.Z. Liu, L. Wang, D.C. Li, The Promotion of Mechanical Properties by Bone Ingrowth in Additive-Manufactured Titanium Scaffolds, J. Func. Biomater.13(3) (2022) 16.[34] D.J. Yoo, Porous scaffold design using the distance field and triply periodic minimal surface models, Biomaterials 32(31) (2011) 7741-7754.[35] A. Karako?, RegionTPMS - Region based triply periodic minimal surfaces (TPMS) for 3-D printed multiphase bone scaffolds with exact porosity values, SoftwareX 16 (2021) 8.[36] H. Chen, Q. Han, C.Y. Wang, Y. Liu, B.P. Chen, J.C. Wang, Porous Scaffold Design for Additive Manufacturing in Orthopedics: A Review,Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (2020) 20.[37] Y.T. Lu, W.Y. Zhao, Z.T. Cui, H.X. Zhu, C.W. Wu, The anisotropic elastic behavior of the widely-used triply-periodic minimal surface based scaffolds, J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 99 (2019) 56-65.[38] Y.T. Lu, Y. Huo, J.A. Zou, Y.C. Li, Z.Y. Yang, H.X. Zhu, C.W. Wu,Comparison of the design maps of TPMS based bone scaffolds using a computational modeling framework simultaneously considering various conditions, Proc. Inst. Mech. Eng. Part H-J. Eng. Med. 236(8) (2022) 1157- 1168.[39] L.P. Wang, Q. Chen, P. Yarlagadda, F.P. Zhu, Q.W. Li, Z.Y. Li, Singleparameter mechanical design of a 3D-printed octet truss topological scaffold to match natural cancellous bones, Mater. Des. 209 (2021) 12.[40] S. Arabnejad, R.B. Johnston, J.A. Pura, B. Singh, M. Tanzer, D. Pasini, High-strength porous biomaterials for bone replacement: A strategy to assess the interplay between cell morphology, mechanical properties, bone ingrowth and manufacturing constraints, Acta Biomaterialia 30 (2016) 345-356.[41] M. Nonomura, K. Yamada, T. Ohta, Formation and stability of double gyroid in microphase-separated diblock copolymers, J. Phys.-Condes.Matter 15(26) (2003) L423-L430.[42] A. Aksimentiev, M. Fialkowski, R. Holyst, Morphology of surfaces in mesoscopic polymers, surfactants, electrons, or reaction-diffusion systems: Methods, simulations, and measurements, in: I. Prigogine, S.A. Rice (Eds.), Advances in Chemical Physics, Volume 121, John Wiley & Sons Inc,Hoboken, 2002, pp. 141-239.[43] F. Sadeghi, M. Baniassadi, A. Shahidi, M. Baghani, TPMS metamaterial structures based on shape memory polymers: Mechanical,thermal and thermomechanical assessment, J. Mater. Res. Technol-JMRT 23 (2023) 3726-3743.[44] N.V. Viet, N. Karathanasopoulos, W. Zaki, Mechanical attributes and wave propagation characteristics of TPMS lattice structures, Mech. Mater. 172 (2022) 12.[45] B.M. Cote, W.R. Lenart, C.J. Ellison, V.E. Ferry, Surface Structure Dependent Circular Dichroism in Single and Double Gyroid Metamaterials,Adv. Opt. Mater. 10(13) (2022) 10.[46] Y.T. Lu, L.L. Cheng, Z.Y. Yang, J.Y. Li, H.X. Zhu, Relationship between the morphological, mechanical and permeability properties of porous bone scaffolds and the underlying microstructure, PLoS One 15(9) (2020) 19.[47] J. Li, D.S. Chen, H.Q. Luan, Y.Y. Zhang, Y.B. Fan, Numerical Evaluation and Prediction of Porous Implant Design and Flow Performance, Biomed Res. Int. 2018 (2018) 13.[48] I. Maskery, N.T. Aboulkhair, A.O. Aremu, C.J. Tuck, I.A. Ashcroft, Compressive failure modes and energy absorption in additively manufactured double gyroid lattices, Addit. Manuf. 16 (2017) 24-29.[49] M. McGregor, S. Patel, S. McLachlin, M. Vlasea, Architectural bone parameters and the relationship to titanium lattice design for powder bed fusion additive manufacturing, Addit. Manuf. 47 (2021) 18.[50] C.M. Haslauer, J.C. Springer, O.L.A. Harrysson, E.G. Loboa, N.A. Monteiro-Riviere, D.J. Marcellin-Little, <i>In vitro</i> biocompatibility of titanium alloy discs made using direct metal fabrication, Med. Eng. Phys. 32(6) (2010) 645-652.[51] F. Bartolomeu, M.M. Costa, N. Alves, G. Miranda, F.S. Silva,Selective Laser Melting of Ti6Al4V sub-millimetric cellular structures:Prediction of dimensional deviations and mechanical performance, J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 113 (2021) 9.[52] J.P. Li, J.R. de Wijn, C.A. van Blitterswijk, K. de Groot, The effect of scaffold architecture on properties of direct 3D fiber deposition of porous Ti6Al4V for orthopedic implants, J. Biomed. Mater. Res. Part A 92A(1)(2010) 33-42.[53] J.J. Weng, Y. Su, Nuclear matrix-targeting of the osteogenic factor Runx2 is essential for its recognition and activation of the alkaline phosphatase gene, Biochim. Biophys. Acta-Gen. Subj. 1830(3) (2013)2839-2852.[54] P. Ducy, R. Zhang, V. Geoffroy, A.L. Ridall, G. Karsenty, Osf2/Cbfa1: a transcriptional activator of osteoblast differentiation, Cell 89(5) (1997) 747-54.[55] U. Kresnoadi, M. Nizar, Soekobagiono, Increased Expression of RUNX2 and ALP Resulting from a Combination of Propolis Extract and Bovine Bone Graft in Socket Preservation Material, Braz. J. Pharm. Sci.58 (2022) 12.[56] S. Thanakun, C.P.N. Mahasarakham, S. Pomprasertsuk-Damrongsri, Y. Izumi, Correlation of plasma osteopontin and osteocalcin with lower renal function in dental patients with carotid artery calcification and tooth loss, J. Oral Biosci. 61(3) (2019) 183-189.[57] J.Y. Si, C.W. Wang, D.H. Zhang, B. Wang, W.W. Hou, Y. Zhou, Osteopontin in Bone Metabolism and Bone Diseases, Med. Sci. Monitor 26 (2020) 9.[58] A. Singh, G. Gill, H. Kaur, M. Amhmed, H. Jakhu, Role of osteopontin in bone remodeling and orthodontic tooth movement: a review, Prog. Orthod. 19 (2018) 8.[59] M. Ikegame, S. Ejiri, H. Okamura, Expression of Non-collagenous Bone Matrix Proteins in Osteoblasts Stimulated by Mechanical Stretching in the Cranial Suture of Neonatal Mice, J. Histochem. Cytochem. 67(2) (2019) 107-116.[60] T. Komori, Functions of Osteocalcin in Bone, Pancreas, Testis, and Muscle, Int. J. Mol. Sci. 21(20) (2020) 15.[61] E. Duman, E.S. Kehribar, R.E. Ahan, E. Yuca, U. Seker, Biomineralization of Calcium Phosphate Crystals Controlled by Protein- Protein Interactions, ACS Biomater. Sci. Eng. 5(9) (2019) 4750-4763.[62] Y.Q. Lu, S. Zhang, Y.Z. Wang, X.Z. Ren, J.X. Han, Molecular mechanisms and clinical manifestations of rare genetic disorders associated with type I collagen, Intractable Rare Dis. Res. 8(2) (2019) 98-107.[63] F.G. Thankam, M.F. Dilisio, R.M. Gross, D.K. Agrawal, Collagen I: a kingpin for rotator cuff tendon pathology, Am. J. Transl. Res. 10(11) (2018) 3291-3309.[64] C. Wan, Z.X. Hao, S.Z. Wen, H.J. Leng, A Quantitative Study of the Relationship between the Distribution of Different Types of Collagen and the Mechanical Behavior of Rabbit Medial Collateral Ligaments, PLoS One 9(7) (2014) 9.[65] W.W. Luo, Y. Wang, Q. Han, Z.H. Wang, J.H. Jiao, X.Q. Gong, Y. Liu,A.B. Zhang, H. Zhang, H. Chen, J.C. Wang, M.F. Wu, Advanced strategies for constructing interfacial tissues of bone and tendon/ligament, J. Tissue Eng. 13 (2022) 31.[66] E.V. Geiger, D. Henrich, S. Wutzler, D.S. Ller, H. Jakob, J.M. Frank,I. Marzi, The Role of <i>TNXB</i> Single-Nucleotide Polymorphisms in Recurrent Shoulder Dislocation, J. Orthop. Res. 31(2) (2013) 295-299.[67] G.Y. Zhang, Y. Ezura, I. Chervoneva, P.S. Robinson, D.P. Beason, E.T. Carine, L.J. Soslowsky, R.V. Iozzo, D.E. Birk, Decorin regulates assembly of collagen fibrils and acquisition of biomechanical properties during tendon development, J. Cell. Biochem. 98(6) (2006) 1436-1449.[68] S. Matheson, H. Larjava, L. H?kkinen, Distinctive localization and function for lumican, fibromodulin and decorin to regulate collagen fibril organization in periodontal tissues, J. Periodont. Res. 40(4) (2005) 312-324.[69] P. Alberton, C. Popov, M. Pr?gert, J. Kohler, C. Shukunami, M. Schieker, D. Docheva, Conversion of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells into Tendon Progenitor Cells by Ectopic Expression of Scleraxis, Stem Cells and Development 21(6) (2012) 846-858.[70] A.H. Huang, S.S. Watson, L.Y. Wang, B.M. Baker, H. Akiyama, J.V.Brigande, R. Schweitzer, Requirement for scleraxis in the recruitment of mesenchymal progenitors during embryonic tendon elongation, Development 146(20) (2019) 8.[71] C. Shukunami, A. Takimoto, Y. Nishizaki, Y. Yoshimoto, S. Tanaka, S.Miura, H. Watanabe, T. Sakuma, T. Yamamoto, G. Kondoh, Y. Hiraki, Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes, Sci Rep 8 (2018) 17.[72] J.J. Luo, M. Tamaddon, C.Y. Yan, S.H. Ma, X.L. Wang, F. Zhou, C.Z.Liu, Improving the fretting biocorrosion of Ti<sub>6</sub>Al<sub>4</sub>V alloy bone screw by decorating structure optimised TiO<sub>2</sub> nanotubes layer, J. Mater. Sci. Technol. 49 (2020) 47-55.[73] H. Liang, T. Ji, Y. Zhang, Y. Wang, W. Guo, Reconstruction with 3Dprinted pelvic endoprostheses after resection of a pelvic tumour, Bone Joint J. 99B(2) (2017) 267-275.[74] R. Jayasree, K. Raghava, M. Sadhasivam, P.V.V. Srinivas, R. Vijay, K.G. Pradeep, T. Rao, D. Chakravarty, Bi-layered metal-ceramic component for dental implants by spark plasma sintering, Mater. Lett. 344 (2023) 4.[75] J.H. Tan, C.K. Cheong, H.W.D. Hey, Titanium (Ti) cages may be superior to polyetheretherketone (PEEK) cages in lumbar interbody fusion: a systematic review and meta-analysis of clinical and radiological outcomes of spinal interbody fusions using Ti versus PEEK cages,European Spine Journal 30(5) (2021) 1285-1295.[76] A. Ronca, L. Ambrosio, D.W. Grijpma, Design of porous threedimensional PDLLA/nano-hap composite scaffolds using stereolithography, J. Appl. Biomater. Funct. Mater. 10(3) (2012) 249-258.[77] J.X. Cai, Y.B. Ma, Z.C. Deng, On the effective elastic modulus of the ribbed structure based on Schwarz Primitive triply periodic minimalsurface, Thin-Walled Struct. 170 (2022) 10.[78] W. Liu, L. Sang, Z.H. Zhang, S.L. Ju, F. Wang, Y.P. Zhao, Compression and resilient behavior of graded triply periodic minimal surface structures with soft materials fabricated by fused filament fabrication, J. Manuf. Process. 105 (2023) 1-13.[79] N. Qiu, Y.H. Wan, Y.J. Shen, J.G. Fang, Experimental and numerical studies on mechanical properties of TPMS structures, Int. J. Mech. Sci. 261 (2024) 18.[80] T.Y. Gao, K. Liu, X.X. Wang, Z.D. Li, Z.G. Wang, Elastic mechanical property hybridization of configuration-varying TPMS with geometri continuity, Mater. Des. 221 (2022) 15.[81] X.X. Wang, T.Y. Gao, C. Shi, Y. Zhou, Z.D. Li, Z.G. Wang, Effect of geometric configuration on compression behavior of 3D-printed polymeric triply periodic minimal surface sheets, Mech. Adv. Mater. Struct. 30(11)(2023) 2304-2314.[82] E.N. Ahmed, A. Bottaro, Flow through porous metamaterials formed by TPMS-based unit cells: Effects of advection, Eur. J. Mech. B-Fluids 100(2023) 202-207.
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