③植入種植體及骨增量: 于拔牙窩內(nèi)手動旋入實驗用種植體，至種植體平臺水平高于頰側(cè)牙槽嵴頂約2 mm，即種植體頰側(cè)冠方2 mm 處暴露在骨壁之外，舌側(cè)完全位于骨壁內(nèi)，如圖1F ～ H。實驗組的骨增量操作:首先，使用兩把鑷子分別加持頰側(cè)黏骨膜瓣的近遠中冠方邊緣，稍微用力提起黏骨膜瓣可形成口袋狀。將Bio－Oss 小顆粒骨移植材料用氯化鈉注射液浸濕后覆蓋于種植體頰側(cè)，并嚴密充滿頰側(cè)黏骨膜瓣所形成的口袋，如圖1I。再將頰側(cè)黏骨膜瓣與舌側(cè)瓣拉攏對位縫合。對照組的骨增量操作為: 先根據(jù)兩顆切齒頰側(cè)骨壁的尺寸和形狀修剪Bio－Gide 可吸收生物膠原膜，保證長度足夠覆蓋牙槽嵴頂及舌側(cè)。使用15c 刀片輕輕劃斷頰側(cè)黏骨膜瓣偏根方的骨膜組織，避免割斷全層組織，此時可見少量出血，如圖1J。將修剪合適的生物膠原膜插入口袋狀的黏骨膜瓣內(nèi)側(cè)，血液浸透膠原膜根方，使其與黏骨膜瓣的根方貼合，冠方仍保持干燥直立，如圖1K。同樣將Bio－Oss小顆粒骨移植材料用氯化鈉注射液浸濕后覆蓋于種植體頰側(cè)，并嚴密充滿頰側(cè)黏骨膜瓣所形成的口袋，如圖1L。此時將生物膠原膜向舌側(cè)反折，完全覆蓋牙槽嵴頂后插入到舌側(cè)黏骨膜瓣內(nèi)，再使用氯化鈉注射液潤濕，使之貼合，如圖1M。將頰側(cè)黏骨膜瓣與舌側(cè)瓣拉攏對位縫合，如圖1N。
10 倍物鏡采集切片全圖，種植體、頰舌側(cè)骨壁及軟組織均完整可見。術(shù)后1 個月A 組: 種植體頰側(cè)附著有新生編織骨結(jié)構(gòu)，內(nèi)部骨細胞排列不規(guī)則，少量成骨細胞可見，如圖2A、B。B組: 種植體頰側(cè)覆蓋大量淋巴細胞，其外表面為原宿主板層骨結(jié)構(gòu)，如圖2C～E。術(shù)后3 個月A 組: 種植體頰側(cè)新生編織骨組織中骨細胞排列規(guī)則程度提高，如圖3A、B。B 組: 種植體頰側(cè)附著新生編織骨，骨細胞排列均較為紊亂，如圖3C、D。術(shù)后6 個月A、B 兩組均可見種植體頰側(cè)粉色成熟板層骨結(jié)構(gòu)，如圖4A～D。
早在1925 年，Blaisdell 發(fā)表了一篇經(jīng)典文章，首次將骨膜描述為一個具有兩層結(jié)構(gòu)的組織［13］?，F(xiàn)在我們更詳細地知道骨膜是一種薄而堅韌的結(jié)締組織，通過Sharpey 纖維固定在骨面上。通常，我們將骨膜分為淺表的纖維層和深面的生發(fā)層。纖維層，顧名思義富含網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膠原纖維束和成纖維細胞，占骨膜總體積結(jié)構(gòu)比例較大［14］。纖維層為肌腱和韌帶提供附著點，從而還起到了結(jié)構(gòu)支持和穩(wěn)定作用。生發(fā)層位于纖維層內(nèi)側(cè)，與骨外表面接觸。雖然生發(fā)層較薄且疏松，但其中含有豐富的血管和細胞。其細胞成分包括未分化的間充質(zhì)干細胞、骨祖細胞、成骨細胞、破骨細胞，成纖維細胞和血管周細胞［15］。從組織學結(jié)構(gòu)來看，纖維層為骨膜組織提供營養(yǎng)及支持，而生發(fā)層是骨膜發(fā)揮生理功能的結(jié)構(gòu)，其中未分化的間充質(zhì)細胞在成骨過程中起到了關鍵作用，它們有助于骨的生長、愈合和修復再生［16］。另外，骨膜血管不僅為骨膜提供營養(yǎng)，還參與骨膜的成骨活動。由于骨膜血管密度高，骨膜內(nèi)含有豐富的血管周細胞( pericyte) ，即與毛細血管內(nèi)皮細胞有物理接觸的細胞［17］。血管周細胞具有一定分化潛能，在骨膜成骨的過程中，能夠分化為成骨細胞［18］，作為生發(fā)層細胞的補充來源［5， 11］。
骨的發(fā)生有兩種方式，軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨［19-20］。這種成骨機制的差異主要與不同解剖部位的組織性質(zhì)有關，長骨的形成依靠軟骨內(nèi)成骨方式，而顱面骨的形成以及骨的改建過程多依靠骨膜內(nèi)成骨方式［21］。血供和氧含量在一定程度上也影響著骨膜成骨的方式。當血供、氧氣充足時，間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞，發(fā)生膜內(nèi)成骨; 血供不足則導致細胞迅速增殖形成軟骨而不是骨［22］。膜內(nèi)成骨過程還會因骨膜結(jié)構(gòu)被擾亂而誘導形成軟骨。Girgis等［23］在刮除大鼠頂骨骨膜后制造骨折模型，結(jié)果發(fā)生了軟骨愈合。Uddstromer 等［24］將銳性分離得到的骨膜移植到三種不同的肌肉組織中，全都實現(xiàn)了異位成骨。而將肋骨骨膜生發(fā)層剝離“撕下”后再用于修復脛骨缺損，未能發(fā)生成骨。這說明利用骨膜成骨時，保證骨膜的完整性至關重要［25］。保證骨膜生發(fā)層的完整，間充質(zhì)細胞才能分化出成骨細胞，繼而形成新骨。
GBR是目前口腔種植臨床中最常用的骨增量術(shù)式。GBR的原理是通過屏障膜建立一個隔離的空間，使骨組織在一個無干擾、受保護的條件下發(fā)揮其自然愈合能力。然而，人工屏障膜的放置也在一定程度上阻隔了骨膜與植骨區(qū)域的血供和細胞交通。另一方面，GBR術(shù)中為了實現(xiàn)創(chuàng)口的無張力關閉，需要離斷頰側(cè)瓣的骨膜層進行減張，這一操作破壞了骨膜結(jié)構(gòu)的完整性，損傷了骨膜生發(fā)層。這些因素都使得骨膜的成骨潛能在GBR術(shù)式中得不到充分利用。
SPAL 技術(shù)利用完整的骨膜來容納并覆蓋骨移植材料從而修復種植體頰側(cè)骨缺損。該術(shù)式與傳統(tǒng)GBR的核心區(qū)別在于保證骨膜完整性且不使用人工屏障膜。骨膜表面富含粗大的膠原纖維束，完全可以阻擋纖維組織的過早長入［26］，代替了人工膜的機械屏障作用，為骨組織生長提供充足時間。更關鍵的是，骨膜生發(fā)層能夠?qū)堑男迯托栽偕^程提供血供支持和豐富的細胞成分。骨膜的成骨潛能會因手術(shù)創(chuàng)傷而被激活，各種細胞因子、生長因子等可以刺激骨膜衍生細胞的增殖和血管的新生，從而實現(xiàn)成骨［27-28］。在Trombelli 的臨床研究中15 個種植體頰側(cè)存在骨缺損的位點，經(jīng)SPAL 骨增量后愈合3～4個月， 80%的位點達到了完全骨充填，且種植體頰側(cè)骨壁厚度平均為3．1 mm; 12 個種植體頰側(cè)骨壁厚度小于1 mm 的位點，術(shù)后90%實現(xiàn)了大于1．5 mm 的臨床臨界值。
本研究為骨膜引導成骨修復種植體頰側(cè)骨缺損進行了組織學驗證。首先，該動物模型的建立基本符合實際臨床情況，且兩種術(shù)式的各自要點都分別進行了還原。因此，可以說該動物模型的建立是成功的。第二，術(shù)后觀察時間節(jié)點的設置分別對應骨再生過程所遵循的骨生長和發(fā)育的模式。1 個月時，編織骨可以成為薄的、分支狀的板層結(jié)構(gòu)，其中的血管網(wǎng)已連接成熟。由前已知，血管形成和充足的血供對于骨的發(fā)生和維持都極其重要［29］。因此術(shù)后1個月作為一個重要的觀察時間節(jié)點，以評價該板層結(jié)構(gòu)的質(zhì)和量。最初的分支狀編織骨支架可作為板層骨沉積的模板，在術(shù)后3～4 個月時，轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)骨和規(guī)則松質(zhì)骨。此時間節(jié)點的設置可評價相對成熟的板層骨的質(zhì)和量。在術(shù)后第4 個月的時間里，皮質(zhì)骨將完成哈弗系統(tǒng)的改建，從而完成最終成熟。從第4 個月末或第5 個月初時，隨著皮質(zhì)骨板的形成，骨再生的塑形過程將重新開始［30］。因此術(shù)后6個月時，皮質(zhì)骨將清晰可辨，骨小梁結(jié)構(gòu)排列更加緊密，以此作為術(shù)后的最終觀察時間節(jié)點。且臨床中GBR術(shù)后的常規(guī)愈合周期為6 個月，二期手術(shù)打開時可見成骨完全。這三個觀察時間節(jié)點的設置分別對應骨再生過程所遵循的骨生長和發(fā)育的模式。
分析Micro CT 測量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在第一個月的愈合期里兩組種植體頰側(cè)骨壁厚度及骨體積均大幅度下降，主要與原宿主頰側(cè)骨壁的吸收有關。手術(shù)創(chuàng)傷會誘導急性炎癥反應，形成大量破骨細胞吞噬頰側(cè)束狀骨［31］。然而此時B 組種植體頰側(cè)多個水平層面骨壁厚度及整體骨體積均明顯高于A 組。結(jié)合同時期組織切片結(jié)果，在B 組中種植體頰側(cè)硬組織主要為原宿主骨壁，而A 組均為紫色新骨。可以說明術(shù)后早期階段骨膜對原宿主骨壁的保護減少了骨吸收。B 組骨膜瓣充足的血運可快速重建頰側(cè)骨壁的血液循環(huán)，維持原宿主骨壁中骨細胞的活性。充足的血供在一定程度上還能夠提高局部骨組織的抗感染能力，避免存活的骨細胞被吸收［32］。相比于A 組中生物膠原膜對血供的隔離，B 組在一定程度上實現(xiàn)了對原宿主骨量的維持。在修復性骨再生方面，骨膜直接接觸骨增量區(qū)域是具有更好的誘導成骨效果的。第一，覆蓋在成骨區(qū)表面的骨膜表層纖維層中粗大的纖維束交織成網(wǎng)［3］，成功地隔離了頰側(cè)軟組織的優(yōu)先長入，為成骨細胞的進入爭取了時間和空間。并且纖維層作為根方肌腱的附著點起到了結(jié)構(gòu)支持和穩(wěn)定作用，為成骨區(qū)域提供了無干擾、受保護的環(huán)境。第二，骨膜深層的生發(fā)層直接覆蓋成骨區(qū)域，為成骨區(qū)域提供了豐富的間充質(zhì)干細胞和血管周細胞，這些細胞能夠在細胞因子和生長因子的刺激下分化成為骨祖細胞。與此同時，骨膜內(nèi)側(cè)豐富的血管成分為成骨區(qū)域帶去了充足的氧氣、血供和各種生物因子。在合適的條件下，膜內(nèi)成骨程序啟動［17， 20］，骨祖細胞快速直接分化為成骨細胞，從而能夠?qū)崿F(xiàn)成骨細胞的大量生成并發(fā)揮生理功能分泌類骨質(zhì)。而生物膠原膜在阻隔軟組織長入的同時，在一定程度上也阻礙了骨膜生發(fā)層中天然的血管源性細胞和骨源性細胞的進入，不利于成骨細胞的形成。
術(shù)后3 個月時雖然在各個水平層面上兩組種植體頰側(cè)骨壁厚度并無差異，但總的骨壁體積B 組仍高于A 組，說明B 組中骨膜維持骨增量空間的能力要強于生物屏障膜。GBR的原理核心在于要建立一個隔離的空間，使骨組織在一個無干擾、受保護的條件下發(fā)揮其自然愈合能力。我們知道，骨膜堅韌的纖維層為肌腱和韌帶提供附著點，從而能夠起到結(jié)構(gòu)支持和穩(wěn)定作用。且當骨膜受到應力作用時，其纖維彈性組織受牽拉會離開或靠近生發(fā)層［33］，這種位移改變會影響成骨細胞的生理活性，在細胞水平上引起動態(tài)微環(huán)境的改變。合適的應力能夠提高骨膜組織中骨源性和血管源性生長因子的表達，使間充質(zhì)干細胞向成骨細胞發(fā)展，在早期階段加強成骨細胞分化作用［34］。Schmidt 等［35］在兔下頜骨骨膜下安置牽張裝置將骨膜牽開，一段時間后組織學觀察發(fā)現(xiàn)有大量成骨細胞、膠原纖維生成，并有較多骨基質(zhì)沉積，骨膜牽張成骨首次得到了組織學上的證明。
術(shù)后6 個月時，兩組種植體頰側(cè)最終骨量趨于等量。這說明愈合后期A 組也可以生成與B 組等量的編織骨支架結(jié)構(gòu)。骨膜在編織骨向成熟的皮質(zhì)骨和規(guī)則的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的過程中并未顯示出特別的優(yōu)勢。術(shù)后3 個月時，B 組呈現(xiàn)出較為活躍的骨再生狀態(tài)，新生編織骨成熟度較低，而此時A 組基本完成了編織骨形成，已經(jīng)開始向成熟板層骨轉(zhuǎn)化。即B 組成骨進程晚于A 組，這可能與早期階段復雜的應激反應程序有關。B 組術(shù)后1 個月時種植體表面出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤，首先可以排除感染因素，其次，由于后期B 組發(fā)生了種植體骨結(jié)合及頰側(cè)骨再生，所以不排除術(shù)后1 個月時的炎癥反應屬于積極現(xiàn)象，淋巴細胞的大量生成或許是自噬機制被激活后促進炎癥過程的表現(xiàn)［36-38］。真核細胞在應激狀態(tài)下會啟動自噬機制，改變細胞的功能及代謝［39］。研究表明，自噬過程可以促進成骨細胞的分化，維持骨細胞的生存。還可以降低破骨細胞數(shù)量，抑制破骨細胞分化，并且能減弱其骨吸收作用［40］。以上這些作用對于新骨生成和原宿主頰側(cè)骨壁的保留都具有積極作用，但要確定B 組中炎癥反應是否與自噬相關還需要進一步的細胞學、分子生物學的研究。術(shù)后6 個月的組織切片結(jié)果表明A 組和B 組最終均實現(xiàn)了種植體骨結(jié)合和頰側(cè)骨再生。在愈合后期主要完成的是哈弗系統(tǒng)的改建和骨再生的塑形過程，最終兩組形成的成熟新骨骨量是相同的。這與目前臨床已完成的病例結(jié)果相吻合。
應用SPAL 技術(shù)的愈合期間無纖維組織長入成骨區(qū)，術(shù)后6 個月可實現(xiàn)種植體骨結(jié)合及頰側(cè)骨再生，效果與放置屏障膜的GBR技術(shù)無顯著差異。且骨膜替代人工屏障膜有利于維持原始骨壁，且具有更好的空間維持作用。
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